2.2 Подготовка ксилемы льна к экспериментальной части
1) Фиксировали замороженную ксилему при 1000С тридцать минут.
2) Сушили 60 минут при 600С.
3) Измельчали ксилему на «мельнице».
Отчистка от непрочносвязынных пектиновых и гемицеллюлозных веществ
1) 2 гр. ксилемы заливаем 100 гр. 1% оксалата аммония.
2) Эту колбу с смесью кипятим на водяной бане 60 минут при 970С, при этом колба закрыта.
3) Охлаждаем колбу.
4) Эту смесь центрифугируем 10 мин на 4000 об/мин и сливаем надосадочную жидкость.
5) Еще раз заливаем 1% оксалатом аммония нашу смесь и кипятим на водяной бане 30 мин., также центрифугируем.
6) Вымываем оксалат аммония водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин.
7) Так еще три раза. Проверяем рН универсальной лакмусовой бумажкой.
8) Готовим раствор 4Н КОН и 3% борной кислоты: 44,888 гр. КОН и 6 гр. Н3ВО3 на 200 мл. дисцилированной воды.
9) Заливаем 100 мл раствора к ксилеме и отстаиваем 1 час, затем центрифугируем и выливаем надосадочную жидкость.
10) Промываем водой: заливаем дисцилированную воду в центрифужные стаканчики тщательно перемешиваем и центрифугируем на 4000 об/мин. промываем до тех пор пока рН среды не будет нейтральным.
2.3 Растворение целлюлозы
Получение раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде
1) N, N-диметилацетамид (ДМА) сушили над молекулярными ситами 4А.
2) В колбу присыпали 8 гр. хлорида лития и нагревали в термостате до 1800 в течение 4–5 часов, затем охлаждали и приливали 100 мл. высушенного над молекулярным ситом ДМА.
3) Колбу закрывали стеклянной пробкой и раствор перемешивали на шейкере до растворения хлорида лития (оставляли на ночь).
Выделение прочно связанных полисахаридов из растворенной целлюлозы клеточной стенки ксилемы льна
1) 1 гр. «целлюлозы» суспензировали в 10 мл. воды 40–60 мин.
2) Отделяли на воронке Шота со вставленным нейлоновым фильтром.
3) Осадок промывали на фильтре ацетоном.
4) Выдерживали в ацетоне (10 мл., 60 мин.)
5) Осадок промывали на фильтре ДМА
6) Выдерживали в ДМА (10 мл., 40–60 мин.)
7) Оставляли на ночь в свежей порции ДМА
8) На воронке шота отделяли «целлюлозу»
9) Суспензировали ее в 100 мл раствора хлорида лития в N, N – диметилацетамиде.
10) Колбу закрывали стеклянной пробкой и перемешивали до растворения целлюлозы на шейкере (1–2 дня).
11) Раствор целлюлозы по каплям добавляли к 100 мл. дисцилированной воды при перемешивание на магнитной мешалке. Раствор оставляли на ночь.
12) Отделяли выпавшую целлюлозу на воронке Шота с нейлоновым фильтром и промывали ее два – три раза дисцилированной водой (по 50 мл.) Получили Фильтрат 1
13) Фильтрат 1 Заливали в диалезный мешок 12 – 14 тысяч Дальтон.
14) Диалезный мешок клали в 3-х литровую банк с дисцилированной водой и ставили на магнитную мешалку, воду в банке меняли 4 раза.
15) На роторном испарителе концентрировали раствор.
16) Хроматографируем концентрированный раствор. Готовим 40 пробирок, моем их хромкой и сушим в сушильном шкафу при 1200С.
17) На хроматографе задаем программу (по каплям, 40 пробирок, в одну пробирку 40 капель ≈ 1,8 мл.)
18) В эпиндорф вливаем концентрированный раствор и центрифугируем 5 мин. при 6 000 об/мин.
19) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.
20) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм. (Смотри гафик1)
21) Выпавшую целлюлозу суспензировали в 50 мл 0,01 М растворе NaAc, рН 4,5 + 0,05% NaN3, содержавший 0,1 мл раствора целлюлазы и инкубировали в течение ночи.
22) Раствор фильтровали на воронке Шота и осадок заново суспезировали в новой порции раствора фермента. Мы получили фильтрат 2.
23) Фильтрат 2 обессоливали на колонке Sephadex G-25, элюент 0,02% NaN3. 0,005 гр. Blue Dextran 2000 кД и 0,250 гр. СоCl2 растворяли в 5 мл дисцилированной воды и хроматографируем. Blue Dextran 2000 кД начало 25 мл конец 30 мл. СоCl2 начало 60 мл. конец 73 мл.
24) Хроматографирование на Sepharose CL-4B элюент 0,02% NaN3 и АсNa 10 mM pH 5,5, разделение по молекулярным массам.
25) Определяем количество сахаров методом Дюбуа (фенольным методом). 200 мкл образца+200 мкл 5% раствора фенола, помещаем пробирки в холодную воду и добавляем 1 мл. концентрированной серной кислоты. Кипятим на водяной бане 10 минут и охлаждаем. Измеряем оптическую плотность при 490 нм (Смотри график2).
0 комментариев