Исследование процессов кислотной и термической инактивации

3.5 Исследование процессов кислотной и термической инактивации.

Изучение термо- и рН-стабильности ферментов часто несёт прикладной характер.

Исследование этих характеристик проводится остаточной активностью фермента после выдержки его раствора в течение некоторого времени при определённых рН и температуре [11].

Нами были проведены исследования кинетики кислотной и термической инактивации протеиназ Penicillium wortmannii 2091 и рассчитаны кинетические параметры этого процесса.

При изучении термо- и рН –стабильности раствор препарата выдерживали в фосфатном буфере в диапазоне рН от 5,0 до 12,0 и температур от 30 до 60^оС. Периодически отбирали аликвотные доли раствора и определяли остаточную протеолитическую активность.

Полученные результаты по инактивации обоих ферментов показали, что протеиназа 1 сохраняет активность в широком диапазоне рН. При значении рН 7,0 через 200 часов фермент сохраняет около 90% активности (рис.4). При значениях рН 6,0 – 9,0 активность фермента снижается до 70 – 75%, это указывает на то, что фермент в указанном интервале не подвержен автолизу, а, следовательно, его нативная конформация обладает высокой стабильностью. При значениях рН ниже 6,0 и выше 11,0 каталитическая активность фермента быстро снижается.

Во всех случаях ПА/КлА-const, это свидетельствует о том, что мы имеем дело с одним ферментом.

Термическую инактивацию протеиназ изучали в интервале температур 30 – 60^оС. Протеиназа 1 в области высокой рН-стабильности инактивируется почти полностью при температуре 60^оС в течение 60 часов, в то время как протеиназа 2 при этой же температуре инактивируется полностью уже за 3 часа. Данные свидетельствуют о высокой термостабильности протеиназы 1. Инактивация протеиназы 2, происходящая при высокой температуре, по-видимому, определяется процессом разворачивания белковой глобулы.

Протеиназа 1, обладающая коллагенолитическим действием, нас интересует с практической точки зрения, поэтому были рассчитаны некоторые кинетические характеристики для этого фермента.

Если предположить, что в каждом элементарном акте процесса инактивации фермента под действием Н⁺ - ионов участвует одна его молекула, то кислотную инактивацию можно представить в виде реакции первого порядка. Кинетическое уравнение первого порядка имеет вид:

2,303 lg E₀/E=K,

где Е₀ – исходная активность фермента

Е – активность в момент времени

К – константа скорости инактивации, характеризующая потерю активности в течение часа, час^-1.

		Рис. 4. Динамика кислотной инактивации протеиназы I.

Остаточную активность выражали в процентах от исходной и затем использовали в расчётах констант инактивации. Величину находили, как среднее из 5 – 6 определений (табл.2).

Таблица 2.

Кислотная инактивация протеиназы 1 при температуре 50⁰С.

Как видно из табл.2, при определённом рН, значения констант достаточно близки друг к другу, максимальное отклонение от средних значений не превышает 10 – 15%, что вполне допустимо в исследованиях кинетики химических реакций. Это свидетельствует о том, что процесс инактивации протеиназы 1 является реакцией первого порядка. Различия в значениях при рН 5,0 и 11,0 и при рН 7,0 – 10,0 на целый порядок ещё раз указывают на лабильность фермента в слабо - кислой и слабо - щелочной зонах.

Исследования термической инактивации протеиназы 1 при различных значениях рН позволили рассчитать константы инактивации для температур 30, 40, 50, 60^оС, а затем найти термодинамические параметры этого процесса.

Термодинамические расчёты были проведены только для вышеуказанных температур (табл.3).

Таблица 3.

Термодинамические характеристики активированного комплекса

протеиназы I.

Поскольку инактивация протеиназы была необратимой, для определения энтальпии DН^¹, свободной энергии DF^¹ и энтропии DS^¹ воспользовались теорией абсолютных скоростей Эйринга.

При повышении температуры скорость инактивации возрастает. Это можно объяснить тем, что тепловая энергия разрушает гидрофобные взаимодействия, которые играют важную роль в стабильности белков. В результате происходит развёртывание полипептидной цепи, что подтверждается высокими значениями DS^¹и согласуется с литературными данными.

Таким образом, изменение величины рН вызывает разрушение электростатических сил, и решающую роль в этих условиях в процессе инактивации играют, по-видимому, гидрофобные взаимодействия.